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　　肉品中含有丰富的呈味核苷酸◈✿◈，不仅对肉品风味感知的厚度和复杂性具有重要贡献◈✿◈，还可以评价肉制品品质◈✿◈。肉制品中的游离核苷酸主要来源是肉制品内源物和人为添加◈✿◈。在肉制品中对风味产生影响主要作用的核苷酸有腺苷酸（AMP）◈✿◈、肌苷酸（IMP）◈✿◈、鸟苷酸（GMP）◈✿◈、次黄嘌呤核苷（HxR）◈✿◈、次黄嘌呤（Hx） 5 种◈✿◈，具体结构如图1所示◈✿◈。IMPpg电子游戏液相色谱仪◈✿◈，◈✿◈、GMP◈✿◈、AMP本身就具有鲜味◈✿◈，并且会与谷氨酸钠之间呈现强烈地味的相乘作用◈✿◈，当谷氨酸钠和IMP或GMP混合时◈✿◈，所呈现的鲜味是谷氨酸钠单独呈现鲜味的数倍pg电子Apg下载◈✿◈，◈✿◈，Hx具有苦味◈✿◈，会给肉的整体风味带来负面作用◈✿◈，5 种核苷酸的组成和相互作用形成了肉制品的不同风味◈✿◈。

　　中国肉类食品综合研究中心的纪晓萌◈✿◈、王真◈✿◈、任南*等采用高效液相色谱法对肉制品中IMP◈✿◈、GMP◈✿◈、AMP◈✿◈、Hx◈✿◈、HxR进行检测◈✿◈；拟对提取溶剂◈✿◈、溶液pH值◈✿◈、色谱柱的选择◈✿◈、流动相比例和柱温等条件进行优化◈✿◈，旨在建立操作简便◈✿◈、定量准确◈✿◈、重现性好的检测方法◈✿◈，实现对复杂肉制品基质的检测分析◈✿◈，以期为企业在生产环节中核苷酸含量的监测提供方法◈✿◈，使消费者更了解肉品品质的量化指标◈✿◈，同时也为完善我国肉制品品质的标准体系◈✿◈、建立国家标准提供强有力的技术支持◈✿◈。

　　参考有关文献◈✿◈，运用光电二级阵列管检测器◈✿◈，对5 种核苷酸进行扫描得到光谱图若槻千夏◈✿◈，发现HxR◈✿◈、IMP在248 nm处有最大吸收pg电子游戏官方平台◈✿◈，GMP在254 nm处有最大吸收◈✿◈，AMP在259 nm处有最大吸收pg电子Apg◈✿◈，◈✿◈，Hx在250 nm处有最大吸收◈✿◈。将色谱图叠加得到图2◈✿◈，在254 nm波长处pg电子首页◈✿◈，◈✿◈，AMP◈✿◈、HxR光谱形成交叉点◈✿◈，Hx◈✿◈、IMP光谱形成交叉点◈✿◈，并且都具有较高的响应◈✿◈，同时GMP在此波长下响应值也较高◈✿◈，所以最终实验确定选用检测波长为254 nm◈✿◈。在该波长下◈✿◈，5 种核苷酸的响应均可以满足方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）的要求◈✿◈。

　　选择合适的色谱条件◈✿◈，保证5 种核苷酸的色谱峰可以实现基线分离是进行研究的第一步◈✿◈。在色谱柱和流动相选择上◈✿◈，比较C18柱◈✿◈、Hilic Plus柱◈✿◈、SB-Aq柱3 种色谱柱◈✿◈，同时选取水/甲醇◈✿◈、甲酸水/甲醇◈✿◈、磷酸二氢钾/甲醇◈✿◈、乙酸铵/甲醇的流动相体系◈✿◈，在等度洗脱条件下进行分离◈✿◈。通过查阅文献可知◈✿◈，在5 种核苷酸中◈✿◈，GMP和IMP较为难分离◈✿◈。结果发现◈✿◈，无论在何种流动相条件下◈✿◈，Hilic Plus柱◈✿◈、SB-Aq柱均无法将GMP和IMP分离（图3A◈✿◈、B）◈✿◈。C18柱在磷酸二氢钾/甲醇流动相体系下◈✿◈，可以成功分离5 种核苷酸◈✿◈。最终确定色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm◈✿◈，5 μm）◈✿◈；流动相◈✿◈：0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇＝98∶2（V/V）◈✿◈；流速◈✿◈：1.0 mL/min◈✿◈；检测波长◈✿◈：254 nm◈✿◈；进样量◈✿◈：20 μL◈✿◈。HxR◈✿◈、IMP◈✿◈、GMP◈✿◈、AMP◈✿◈、Hx（10 μg/mL）标准溶液的色谱图见图3C◈✿◈。

　　调节柱温箱的温度◈✿◈，观察不同柱温下色谱峰的出峰时间和分离度的变化◈✿◈。分别考察了柱温为25◈✿◈、30◈✿◈、35 ℃的5 种核苷酸的出峰情况◈✿◈，结果如图4所示◈✿◈。结果表明◈✿◈，5 种核苷酸的出峰时间在25 ℃及30 ℃条件下◈✿◈，出峰时间变化较小◈✿◈；35 ℃条件下◈✿◈，5 种核苷酸的出峰时间后移◈✿◈，并且峰面积变小◈✿◈；不同温度对于5 种核苷酸的分离度影响较小◈✿◈。考虑到实验室通常的仪器配置及检测的环境温度◈✿◈，因此选择柱温为25 ℃◈✿◈。

　　作为化合物分析的第1步◈✿◈，选择合适的提取溶剂◈✿◈，将目标物从样品基质中高效◈✿◈、快速地提取出来◈✿◈，直接影响方法的提取效率和后续的净化步骤◈✿◈。本实验选择5%高氯酸＋5%甲醇若槻千夏◈✿◈、5%高氯酸◈✿◈、5%三氯乙酸◈✿◈、100%乙腈作为提取溶剂◈✿◈，分别考察4 种溶剂的提取效果◈✿◈。由于样品基质本身含有目标化合物◈✿◈，采用基质曲线排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响◈✿◈。

　　对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率◈✿◈。由图5可知◈✿◈，用100%乙腈作提取溶剂时◈✿◈，5 种核苷酸基本没有回收pg电子游戏官方平台◈✿◈，说明核苷酸很难溶解于有机溶剂◈✿◈，从而影响提取效率◈✿◈。用5%三氯乙酸溶液作提取溶剂时◈✿◈，目标化合物的加标回收率在52%左右◈✿◈。用5%高氯酸溶液和5%高氯酸＋5%甲醇溶液作提取溶剂时◈✿◈，目标化合物的加标回收率在65%左右◈✿◈，但甲醇的加入会使实验平行性变差◈✿◈，实验偏差过大◈✿◈。因此选用高氯酸溶液作为提取溶剂◈✿◈。

　　进一步对提取溶剂的体积分数进行优化◈✿◈。选择不同体积分数的高氯酸（1%◈✿◈、5%◈✿◈、10%◈✿◈、15%）◈✿◈，分别考察其提取效果◈✿◈。对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率◈✿◈，实验结果如图6所示◈✿◈。结果表明◈✿◈，当高氯酸的体积分数为1%时◈✿◈，回收率为40%左右◈✿◈；当高氯酸体积分数为15%◈✿◈，回收率为53%左右◈✿◈，但结果偏差较大◈✿◈；当高氯酸体积分数为5%◈✿◈、10%时◈✿◈，回收率约为64%◈✿◈。两者回收率没有明显差异◈✿◈，考虑到酸会对后续处理产生影响◈✿◈，因此选择体积分数较低的5%高氯酸溶液作为提取溶剂◈✿◈。

　　肉制品中脂肪和蛋白质的含量都很高◈✿◈，会对化合物的提取会有一定影响◈✿◈。选择合适的提取方式◈✿◈，有助于减小基质对于化合物的干扰◈✿◈，减少净化难度◈✿◈。本实验考察常见的4 种提取方式◈✿◈：室温超声30 min◈✿◈、冰浴超声30 min◈✿◈、常温振荡器振荡30 min◈✿◈、添加陶瓷均质子涡旋30 min◈✿◈。由于样品基质本身含有目标化合物◈✿◈，采用基质曲线排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响◈✿◈。

　　对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率◈✿◈，实验结果如图7所示◈✿◈。室温超声30 min的回收率约为58%◈✿◈，冰浴超声30 min的回收率约为60%◈✿◈，两者没有明显差异◈✿◈。常温振荡器振荡30 min的回收率约为70%◈✿◈，添加陶瓷均质子涡旋30 min的回收率约为67%◈✿◈，两者在回收率上无明显差异◈✿◈。但添加陶瓷均质子涡旋30 min得到的提取溶液表面有较多油脂悬浮◈✿◈，会对后续操作产生干扰◈✿◈，对比照片见图8◈✿◈。因此在提取时选择常温振荡器振荡30 min◈✿◈。

　　进一步对振荡器振荡过程的提取时间进行优化◈✿◈。选择不同提取时间（10◈✿◈、20◈✿◈、30◈✿◈、40 min）考察其提取效果◈✿◈。对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率◈✿◈，实验结果如图9所示◈✿◈。结果表明pg电子游戏官方平台◈✿◈，在提取10 min后◈✿◈，回收率约为40%◈✿◈，且偏差较大◈✿◈，说明还未提取完全◈✿◈。随着提取时间的延长◈✿◈，回收率逐渐升高◈✿◈，从30 min到40 min时◈✿◈，回收率逐渐稳定在70%左右◈✿◈。因此选择提取时间为30 min◈✿◈。

　　在提取过程需要用到大量的酸保证游离核苷酸充分离子化◈✿◈，充分溶解◈✿◈。但提取液中酸会对后续操作产生干扰◈✿◈，也会影响色谱柱柱效◈✿◈，影响分析物保留时间和分离效果◈✿◈。因此◈✿◈，在定容之前需要对提取液的pH值进行调整◈✿◈。本实验比较不同pH值（5.5◈✿◈、6.0◈✿◈、6.5◈✿◈、7.0）提取溶剂的提取效果◈✿◈。由于样品基质本身含有目标化合物◈✿◈，采用基质曲线◈✿◈，以排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响◈✿◈。

　　对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率◈✿◈，实验结果如图10所示◈✿◈。提取溶液pH值从5.5增加到6.5◈✿◈，回收率升高◈✿◈，提取溶液pH值从6.5增加到7.0◈✿◈，回收率降低◈✿◈，在pH 6.5时回收率最高◈✿◈。因此提取液pH值为6.5◈✿◈。

　　为了进一步锁定合适的pH值范围◈✿◈，对pH值进一步细化◈✿◈。本实验设置了几个不同的提取液pH值（6.1◈✿◈、6.3◈✿◈、6.5◈✿◈、6.7◈✿◈、6.9）◈✿◈，探究其对回收率的影响◈✿◈，实验结果如图11所示◈✿◈。取溶液pH值从6.1增加到6.3时◈✿◈，回收率升高◈✿◈，pH值从6.3到增加6.7时◈✿◈，回收率随pH值的变化并不明显◈✿◈，提取溶液pH值从6.7到增加6.9时◈✿◈，回收率降低◈✿◈。因此◈✿◈，选取提取液pH值为6.5±0.2◈✿◈。

　　从之前的优化结果看◈✿◈，回收率约为70%◈✿◈，仍旧偏低◈✿◈，为了提高回收率◈✿◈，试图通过增加提取次数的方式提高回收率◈✿◈。如图12所示◈✿◈，提取1 次的回收率为73%左右◈✿◈，提取2 次的回收率约为95%◈✿◈，提取3 次的回收率约为96%◈✿◈，提取2 次和提取3 次的回收率没有明显差异◈✿◈。因此◈✿◈，实验采用2 次提取方式◈✿◈，实验回收率达到95%◈✿◈。

　　样品经过提取后◈✿◈，上清液中还含有大量油脂和蛋白质等杂质◈✿◈，杂质的分子质量较大◈✿◈，在流动相中流动缓慢◈✿◈，极易堵塞色谱柱◈✿◈，还会对目标物的检测产生基质干扰◈✿◈，降低方法的灵敏度◈✿◈。为了能有效对样品进行净化◈✿◈，除去油脂◈✿◈、蛋白质等基质干扰◈✿◈，需要选择合适的净化方式◈✿◈。本实验选择固相萃取法◈✿◈、液液萃取法2 种方式进行样品净化◈✿◈。经查阅文献◈✿◈，选择MCX柱◈✿◈、HLB柱◈✿◈、WAX柱◈✿◈、PSA柱等不同固相萃取柱类型◈✿◈。实验发现◈✿◈，由于5 种核苷酸的化学性质差异较大◈✿◈，没有一种固相萃取柱可以对5 种核苷酸均有较好保留pg电子◈✿◈。◈✿◈。实验还验证了通过型PRIME HLB固相萃取柱◈✿◈，发现过柱后的提取液并未变得澄清◈✿◈，色谱图中杂质峰也未减少◈✿◈，而且会导致样品平行性变差◈✿◈。实验中还尝试了正己烷液液萃取法除去杂质◈✿◈。实验结果见图13◈✿◈，经正己烷净化后的提取溶液变更澄清◈✿◈，同时核苷酸的回收率没有减小◈✿◈。因此◈✿◈，净化方式采用正己烷液液萃取法◈✿◈。

　　用优化好的色谱条件◈✿◈，用液相色谱测定系列标准工作液◈✿◈。以测得峰面积（Y）为纵坐标◈✿◈，对应的标准溶液质量浓度（X）为横坐标◈✿◈，绘制标准曲线◈✿◈，其回归方程和决定系数见表1◈✿◈。5 种核苷酸在0.5～80 μg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系◈✿◈。

　　本方法选取猪肉脯◈✿◈、酱牛肉◈✿◈、腊肉◈✿◈、火腿肠◈✿◈、烧鸡作为代表样品◈✿◈，添加适量标准工作液进行实验◈✿◈，考察方法的LOD和LOQpg电子官网◈✿◈，◈✿◈。经回收率实验◈✿◈，当添加量为5 mg/kg时◈✿◈，信噪比（RSN）均大于3◈✿◈；当添加量为15 mg/kg时◈✿◈，RSN均大于10◈✿◈，色谱图见图14◈✿◈。所以本方法的LOD确定为5.0 mg/kg◈✿◈，LOQ确定为15.0 mg/kg◈✿◈。

　　将配制的5 种核苷酸的储备液◈✿◈，并于4 ℃冰箱保存◈✿◈，分别在保存1◈✿◈、2◈✿◈、3◈✿◈、4◈✿◈、5◈✿◈、6 个月的时间点取样进行分析◈✿◈，记录化合物峰面积◈✿◈，按式（2）计算剩余分析物含量◈✿◈。由表2可知◈✿◈，储备液在3 个月之内响应值变化较小◈✿◈，表明标准储备液有效期定为3 个月可行◈✿◈。

　　将储备液稀释成质量浓度为100 μg/mL的混合标准工作液◈✿◈，并于4 ℃冰箱保存◈✿◈，按照0.5◈✿◈、1◈✿◈、1.5◈✿◈、2 个月的时间保存取样并进行分析◈✿◈，记录化合物峰面积◈✿◈。按式（2）计算剩余分析物含量◈✿◈。根据表3的数据变化可知◈✿◈，混合标准工作液在1 个月之内响应值变化较小◈✿◈。因此◈✿◈，混合标准工作液有效期定为1 个月可行◈✿◈。

　　按照GB/T 19480—2009《肉与肉制品术语》中对肉制品的分类◈✿◈，结合日常生活中肉制品的食用频率◈✿◈，本实验选取猪肉脯◈✿◈、酱牛肉◈✿◈、腊肉◈✿◈、火腿肠◈✿◈、烧鸡作为代表样品◈✿◈，在样品中添加15◈✿◈、30◈✿◈、150 mg/kg（LOQ◈✿◈、2 LOQ◈✿◈、10 LOQ）的核苷酸进行回收率实验◈✿◈，重复进行3 次◈✿◈，实验色谱图见图15◈✿◈，实验数据见表4◈✿◈。实验得出15～150 mg/kg添加水平范围的回收率为80.1%～109.5%◈✿◈，相对标准偏差为 9.6%（n＝3）◈✿◈。

　　从北京某连锁超市购买肉制品若槻千夏◈✿◈，选取了生活中经常食用的肉制品◈✿◈，取可食部分◈✿◈，经组织研磨仪研磨后◈✿◈，按照优化好的方法进行检测◈✿◈。实验数据见表5◈✿◈。15 个实际样品检测均检出IMP◈✿◈、Hx◈✿◈、AMP◈✿◈、HxR◈✿◈，部分样品未检出GMP◈✿◈，含量为19.5～816 mg/kg◈✿◈。5 种核苷酸中◈✿◈，IMP◈✿◈、Hx◈✿◈、HxR的含量较高◈✿◈，GMP的含量最低◈✿◈，实验结果与王永瑞◈✿◈、黎琪等的研究结果一致pg电子游戏官方平台◈✿◈。

　　本研究建立了采用高效液相色谱仪同时测定肉制品中5 种游离核苷酸的检测方法◈✿◈，对仪器检测条件和前处理方法进行了优化◈✿◈，确定了检测波长◈✿◈，探究了流动相和色谱柱对待测物的影响◈✿◈，经过优化后◈✿◈，基线 种游离核苷酸得到有效分离◈✿◈，进而对提取溶剂◈✿◈、提取方式◈✿◈、提取次数及净化方式等条件进行了优化◈✿◈，最终实现了同时对肉制品中5 种游离核苷酸的定量检测◈✿◈。另外用该方法对市售的15 个肉制品进行了检测◈✿◈，发现IMP◈✿◈、Hx◈✿◈、AMP◈✿◈、HxR均有检出◈✿◈，GMP部分检出◈✿◈，不同肉制品中核苷酸检出含量差异较大◈✿◈，在19.5～816 mg/kg之间◈✿◈。与目前测定相似基质的团体标准T/NAIA 003—2020《肌肉中肌苷◈✿◈、肌苷酸的测定 高效液相色谱法》对比◈✿◈，本研究中流动相为低浓度的磷酸盐◈✿◈，没有用到高浓度的三乙胺作为流动相◈✿◈，有效地保护了色谱柱◈✿◈；检测物质由2 种增加到5 种◈✿◈，检测物质更加全面◈✿◈；LOQ由0.5 g/kg降低到15.0 mg/kg◈✿◈，灵敏度更高◈✿◈；同时还增加了除脂净化等操作◈✿◈，对于仪器及色谱柱有更好的保护作用◈✿◈。综上所述◈✿◈，本方法操作简便◈✿◈、回收率稳定◈✿◈、重复性好◈✿◈，实用性强◈✿◈、利于广泛推广◈✿◈，不仅适用于肉制品风味评价◈✿◈，也可以为企业在生产环节中监测核苷酸提供方法◈✿◈，同时也为建立国家标准提供强有力的技术支持◈✿◈。

　　本文《高效液相色谱法测定肉制品中多种游离核苷酸》来源于《食品科学》2023年44卷第13期341-350页◈✿◈，作者◈✿◈：纪晓萌 ◈✿◈，王真若槻千夏◈✿◈，任南*◈✿◈，刘梦瑶◈✿◈，孔维恒◈✿◈，赵文涛若槻千夏◈✿◈，王江跃◈✿◈，刘鑫亿◈✿◈，郭文萍◈✿◈。DOI:10.7506/spkx1209-060◈✿◈。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息◈✿◈。

　　实习编辑◈✿◈：栾文莉◈✿◈；责任编辑◈✿◈：张睿梅◈✿◈。点击下方阅读原文即可查看全文◈✿◈。图片来源于文章原文及摄图网

　　为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新◈✿◈，加速科研成果向实际生产力的转化◈✿◈，助力产业实现高质量◈✿◈、可持续发展◈✿◈，由北京食品科学研究院◈✿◈、中国肉类食品综合研究中心◈✿◈、中国食品杂志社将与江西农业大学◈✿◈、江西科技师范大学◈✿◈、 南昌师范学院◈✿◈、 家禽遗传改良江西省重点实验室 共同举办的“ 2025年动物源食品科学与人类健康国际研讨会 ”◈✿◈，将于 2025年10月25-26日 在 中国 江西 南昌 召开◈✿◈。

　　北京食品科学研究院◈✿◈、中国食品杂志社和全国糖酒会组委会将于2025年10月16-18日在江苏省南京市南京国际博览中心举办第113 届全国糖酒会食品科技成果交流会◈✿◈。食品科技成果交流会期间举办食品科技成果展◈✿◈，本届科技成果展以我国当前食品产业科技需求为导向◈✿◈，重点邀请“十四五”以来获得国家和省部级重要科研项目支持产出的食品科技新成果pg电子游戏官方平台◈✿◈、新技术◈✿◈、新产品参展◈✿◈，并针对企业技术需要开展精准对接服务◈✿◈。